内皮素放免试剂盒操作说明书
ET（HY-10044）RIA Kit
内皮素（Endothelin ET）一种首先先由猪的血管内皮细胞中分离纯化出的21个氨基酸组成的生物活性多肽，人的ET有三种基因表达，即ET-1，ET-2，ET-3，其中以ET-1活性最强。内皮素具有强烈的收缩冠状动脉、刺激心钠素（ANP）的释放，提高全身血压，抑制肾素释放等作用，它是迄今为止已知最强的收缩血管物质，现有研究表明，ET浓度与心血管疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、神经系统疾病以及妇产科疾病的发生发展均有密切联系。
药盒组成：
1、ET 抗体一瓶；
2、ET标记一瓶 ；
3、缓冲液（PBS）一瓶（10ml）使用前加蒸馏水至50ml；
4、分离剂（第二抗体）一瓶，
5、ET标准品五瓶：20、60、180、500、1000pg/ml。
样品收集：
1、取静脉血2ml注入含10%EDTA.Na2 30ul和抑肽酶10ul（含100U/ml以上）的试管中，混匀4℃，3000rpm/ min离心10min，分离血浆（溶血样品影响测定结果）。如需要可分装2-3份保存，放-20℃可保存2个月，在-70℃以下可存放半年。测定前，使样本置于室温或冷水中复融，再次4℃，3000rpm/ min离心5min，取上清测定。
2、组织样品的处理：取出活组织，吸去血迹，称重，尽快放入1N HAC 1ml略做碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10分钟，匀浆。4℃，3000rpm/ min离心15min，取上清放-20℃以下保存，测定时用PBS五倍以上稀释，以调节PH值。另外，每种组织的样品非特异结合（U0）可能有差异，每份标本最好单独做一个U0。取组织的重量一般在100mg左右为好。
测定方法：本实验采用非平衡法，取聚苯乙烯编号，按下表操作。
ET RIA 操作程序（单位：ul）
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试 剂 T NSB S0 S1~S5 样 品
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缓 冲 液 —— 200 100 —— ——
标 准 品 —— —— —— 100 ——
样 品 —— —— —— —— 100
抗 体 —— —— 100 100 100
125I-ET 100 100 100 100 100
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混匀，4℃ 温育24小时
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分离剂 —— 500 500 500 500
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混匀，室温放置20分钟，3500转/分 离心20分钟，去上清，测定沉淀cpm值。
结果计算：
以N/T、B/T计算NSB、S0结合百分率，以B/B0计算标准及待测物结合百分率，在
半对数座标纸上绘制标准曲线，并查出样品值或由自动Υ-计数仪器直接读出结果。
注意事项：
1．本月标准品每瓶用 ml缓冲液稀释
本月药盒抗体每瓶用 ml缓冲液稀释
本月药盒标记每瓶用 ml缓冲液稀释
2．测兔标本时，应改用20%PEG 500ul/管 分离；同时NSB、S0 、S1~S5 管加正常人血清
100 ul/管（或r-球蛋白100 ul/管）；U、U0管加缓冲液100ul/管。
本试剂盒主要技术参数：
NSB：<6% ； 灵敏度：5pg/ml； 可测范围：20-1000 pg/ml；
精密度：批内CVW<4.5%，批间CVb<10% 。
特异性：本抗体与a-人心钠素、降钙素基因相关肽（CGRP），血管紧张素Ⅰ、
Ⅱ以及舒血管肠肽（VIP）等均无交叉反应。
正常参考值：50.8±7.58pg/ml。
附注：
1、目前，国外血浆ET的测定，除了直接测定以外，更多的是采用C18硅烷柱层析法提
取，现将此法介绍如下，供参考：采集静脉血5ml，置于含10%EDTA二钠60ul和2000IU(100ul)
抑肽酶的试管中，混匀，4℃，3000rpm/10min离心10min，取血浆2ml,-30℃保存。
2、柱层析法的程序是：将C18硅烷柱依次用蒸馏水30ml，75%乙腈（含1%TFA）10ml, 蒸
馏水30ml淋洗，取血浆2ml加0.1%TFA 6ml混匀,离心3000rpm 20min。将上清液加至柱中，
用蒸馏水30ml淋洗，流出液弃去。向柱内加75%乙腈（含1%TFA）3ml淋洗，收集流出液。
吹干后放-20℃保存。测定时，将吹样品用250ulPBS溶解，充分混匀再次离心，取上清测定，
测定结果除以8倍（2ml血浆提取物溶于250ulPBS 中，）为每ml血浆值。
3、 提取过程中的乙腈最好为优级纯，国产分析纯乙腈质量不稳定，如无乙腈，可用甲
醇和三氟乙酸（TFA）我处可提供。75%乙腈（含0.1%TFA）的配制方法（以100ml
为例）：75ml乙腈+24.5ml蒸馏水+0.5ml 20% TFA。
过C18层析柱法血浆正常值：3.52±1.05pg/ml。
根据我们对130例血浆样品直接测定和过C18柱提取测定的相关实验表明，两者相关非常
显著。（P<0.01）
本月药盒参考数据：
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T NSB S0 S1 S2 S3 S4 S5
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CPM
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N/T% B0/T% B/ B0 %
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生产日期：
有效日期：
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