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血管活性肠肽放免药盒操作说明书
                                                                 VIPHY-10162RIA  KIT   
     
      血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide VIP)是一种脑肠肽,广泛分布于中枢神经系统和消化道,具有多种功能。本药盒适用于血浆提取物,组织提取物及脑脊液内的VIP测定。请认真阅读本说明书,并严格实行。
 
  试剂组成及配制:凡冻干品均保存于-20℃,溶解后避免反复冻融。
1.  鱼精蛋白1瓶,-20℃保存。
2.  缓冲液1瓶,4℃保存。用前在鱼精蛋白瓶中加入1ml蒸馏水溶解,再加1ml缓冲液,此时鱼精蛋白瓶中应呈现白色雾状。如不出现,说明鱼精蛋白已失效,此点十分重要,然后将鱼精蛋白加入缓冲液中。
3.  VIP标准(1024pg)2瓶,保存于-20℃(1瓶用于标准曲线,一瓶用于回收试验), 用前加  2  ml缓冲液,然后做倍比稀释。
4.  125I-VIP 2 瓶, 用前加       ml缓冲液/瓶稀释。
5.  VIP抗体 2瓶,用前加       ml缓冲液/瓶稀释。
6.  免疫沉淀剂 (第二抗体)1瓶。保存于4℃。
7.  无激素人血浆:1瓶.-20℃保存。
8.  抑肽酶、EDTA.Na2、生理盐水,自备。
9.  牛血清白蛋白(BSA):0.5g.. -20℃保存。
 
   样品收集:
 抽取患者晨空腹静脉血2ml ,置于冰壶预冷的试管内,每个试管含10% EDTA.Na2
30ul和抑肽酶1000 KIU。低温离心1500转/分×15分钟,分离血浆,1ml/管,-20℃保存备测(可贮存二个月)。
 
   血浆样本提取:
1.  取出冻存的血浆管,置于自来水浴中复融。
2.  缓慢加入4℃预冷的丙酮2ml混匀。低温离心(1500转×15分)。将上清液倒
入西林瓶中。提取管不要用塑料瓶(管)!!!否则丙酮溶解塑料瓶(管)。将盛有上清液的各管置于凉风下(空调或风扇)将丙酮吹掉后剩余液体用冷冻抽干机抽干。
 
   组织的提取:
   取适宜大小的组织块,立即称重后于1ml 100℃的生理盐水中煮沸3分钟,加1N冰醋酸0.5ml于匀浆器中匀浆提取,再用1N的NaOH 0.5ml中和,离心3000转/分,30分钟(最好是低温离心)。取上清液贮存于-20℃以下待测(样本可保留2 ― 6个月)。
 
回收试验:
1.  取VIP标准一瓶,用缓冲液2 ml溶解,用缓冲液进行倍比稀释,其浓度为512-64pg/0.1ml。
2.  用无激素人血浆配制标准回收管,每管1ml,各加VIP 64,128及256pg/0.1ml。
3.  按血浆标本提取法(1-2)将标准回收管进行提取。
 
     放射免疫分析:在(冰)水浴中进行,10℃以下。
1.于吹干的各标准回收管及标本管内各加入0.01N HCL 167ul,旋转混合使之溶
          解。加入生理盐水(含 0.5%牛血清白蛋白)0.5ml,再旋转混合(适用于血浆
          样本测量)。
2、VIP标准配制:取VIP标准一瓶,加缓冲液2ml,然后倍比稀释,使其浓度为512、256、128、64、32、16、8、4pg/ml,共8管。
 
 
 
操作步骤:本实验用非平衡法加样。
                      VIP     RIA   加液程序           (单位:ul )                                                                                                                                                
       ————————————————————————————————
          试   剂      T      NSB     S0      S1~S8   回收管   样本管
       ————————————————————————————————
         标本提取液   ——    ——    ——     ——    ——     300
        回收管提取液  ——    ——    ——     ——     300     ——
          缓 冲 液    ——    400     300      200     ——     ——
          标 准 品    ——    ——    ——     100     ——     ——
           抗    体      ——    ——    100      100     100      100
        ———————————————————————————————
                        充分混匀,4℃ 放置48小时
        ———————————————————————————————
          125I- VIP     100    100      100      100     100      100
        ———————————————————————————————
                        摇匀4℃ 放置48小时
        ———————————————————————————————
         沉 淀 剂    ——     600     600      600     600     600
        ———————————————————————————————
  混匀,室温放置20分钟,3500转/分4~10℃离心15 分钟,弃上清,测定沉淀cpm数。
 
    结果计算:
     以N/T、B/T计算NSB、S0结合百分率,以B/B0计算标准及待测样品结合百分率,在半对数坐标纸上绘制标准曲线,并查出样品值,或由自动r计数仪预先编制程序。直接给出有关参数,标准曲线及样品浓度。以各标准管B/B0%与各标准管浓度的对数绘制曲线图,在图上查出各标本及回收管含量。
                回收管含量实测值×2.22
      回收率=  ————————————  × 100%
                回收时加入的VIP含量
血浆样本VIP含量(pg/ml)=实测含量×2.22÷回收率。其中2.22为容积校正系数。
血浆样本VIP正常参考值:20.3±18.3pg/ml(X±SD).如有条件,建立本实验室正常值
 
    本月药盒参考数据:
—————————————————————————————————————————
          T      NSB      S0          S1     S2      S3     S4      S5    S6     S7      S8 
    —————————————————————————————————————————
    CPM
    —————————————————————————————————————————
            N/T%        B0/T%        B/ B0 %  
    —————————————————————————————————————————
         
     
生产日期:
有效日期:
 
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