产品应用：用于细胞凋亡检测
产品介绍：
一、原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份
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组份 |
10次 |
20次 |
50次 |
100次 |
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Annexin V-FITC |
20μL |
40μL |
100μL |
200μL |
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Binding Buffer |
5 mL |
10.0 mL |
25 mL |
25 mL×2 |
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Propidium Iodide （PI） |
50μL |
100μL |
250μL |
500μL |
三、操作步骤
1、悬浮细胞离心（离心2000rpm，5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，（注胰酶消化时间不易过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合）
2、用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~5×105细胞；
3、加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；
4、加入2μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；
5、避光、室温反应5min；
根据不同的分析方法选择步骤A或B。
A、荧光显微镜观察
1、滴一滴经过步骤1~5处理过的细胞悬浮液于载玻片，并用盖玻片盖上细胞；
2、对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
（1）将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
（2）用PBS洗涤细胞两次；
（3）在500μL 的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-FITC， 5 μL Propidium Iodide，混匀；
（4）将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；
（5）避光、室温反应5 min。
3、将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察；
Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
B、流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡的情况。（绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL2或FL3来检测）
四、注意事项
- Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。
- Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。
五、储存置于4ºC，可保存一年
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