Caplain Activity（HY-50112）KIT

钙蛋白酶的活化参与许多生理学和病理学的过程（比如细胞凋亡）。其活化与质膜和钙离子有关，被活化的钙蛋白酶会释放到细胞质中。钙蛋白酶活性分析试剂盒最大特点是提供的抽提液：只提取细胞质蛋白，而不会影响细胞膜和溶酶体酶；还能防止提取过程中的钙蛋白酶的自活化。因此，该钙蛋白酶活性试剂盒只检测经诱导物（比如化学试剂或者药物）处理过的细胞的胞内活化钙蛋白酶。利用荧光检测的方法, 通过检测钙蛋白酶底物Ac-LLY-AFC的酶切降解而实现。Ac-LLY-AFC能发射蓝光（λmax = 400 nm），而被酶切后生成的自由AFC则释放出黄绿光荧光(λmax = 505 nm)，这种荧光可以用荧光计或者荧光分析仪读取数据。对比处理的样品和正常对照组的样品发射的荧光强度，就可以得出钙蛋白酶活性的改变。

试剂一：抽提液：25ml  1瓶

试剂二：10X工作液：2ml   1瓶，用时用9倍蒸馏水稀释。

试剂三：钙蛋白酶底物 Ac-LLY-AFC：  1ml 1瓶

试剂四：活性钙蛋白酶 I（阳性对照）：   0.2ml  1瓶

试剂五：钙蛋白酶抑制剂 Z-LLY-FMK：  0.2ml   1瓶

    试剂六：细胞裂解液   20ml   1瓶

1、取标本上清液200微升加入试剂一0.2ml，用振荡器充分混合，

2、将混合后的上清液中细胞放置显微镜计数板下进行细胞计数，调节细胞数，样本200微升（含细胞数约为1-2 ×10⁶  个）。充分混匀，在冰上孵育20分钟

3、用离心机（1000 Xg）离心1分钟，将上清液一部分进行蛋白定量。

4、步骤2处理后的标本分2管，各取100微升，分别加入细胞裂解液100微升、85微升抽提液。然后其中一管加入2微升试剂四活性钙蛋白酶，作为阳性对照，另一管加入2微升试剂五钙蛋白酶抑制剂作为阴性对照

6、在每个测试管中分别加入10微升试剂二工作液和5微升试剂三钙蛋白酶底物

7、37℃，避光，孵育1小时

8、将样本移到96孔板。调机器激发波长400nm发射波长505nm读取样本的荧光值。

9、比较阳性阴性样本检测结果：阳性RFU-阴性RFU为钙蛋白酶活性。活性用样本荧光强度（RFU）/毫克蛋白表示。

  试剂盒保存温度为-70℃（抽提液和10X工作液开盖后4℃保存）

  所有试剂在正确条件下储存，有效期6个月。

 

参考文献：①见BioVision说明书

          ②Gheisari,H.R.;Shekarforoush,S.S.and Aminlari,M. Comparative  studies

            on calpain activity of different muscles of cattle,camel,sheep and goat Iranian Journal of Veterinary Research,University of Shiraz, Vol.8,No.3,Ser.No.20,2007,225-228

 

生产日期：2012-08-16

有效日期：2013-02-16

生产批号：20120816