科研药盒，慎用于临床
乳酸试剂盒说明书
LA(HY-N0056)KIT
乳酸(Lactic acid，LA)系糖元氧代谢的最终产物。当剧烈运动时, 糖元氧代谢加强, 血乳酸水平成倍增加。而糖有氧代谢提高后, 完成同样运动, 血乳酸相对减少。因此血乳酸是评定糖元氧代谢和有氧代谢的重要指标。
一、检测原理：乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD +还原生成NADH和H +，H +传递给PMS生成的PMSH 2 还原MTT生成紫色物质，在570nm处有特征吸收峰。
二、试剂盒组成：
提取液一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液体8mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体34μL×1支，4℃保存。临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：450μL的比例配制试剂二溶液，现用现配。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入4mL蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存一周。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加4mL蒸馏水充分溶解，4℃保存一周。
试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。 临用前每瓶加入3mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存一周。
试剂六：液体2mL×1瓶，4℃保存。
标准品：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.04mL蒸馏水配成100μmol/mL 的标准溶液。
显色液的配制：临用前根据用量按照试剂三（V）：试剂四（V）=1：1的比例充分混匀，现配现用。
三、操作步骤：
A、样本处理：
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液
一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
2. 细胞：按照细胞数量（10 4 个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
3. 血清（浆）：取100μL血清（浆）加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g离心10min后取上清待测。
B、测定操作
1、分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至570nm，分光光度计用乙醇调零。
2、标准液的稀释：将100μmol/mL 的标准溶液用蒸馏水稀释为3、2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μmol/mL的标准溶液待测。
3、加样表：
乳酸操作步骤 单位（ul）
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样本 对照管 标准管 空白管
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样本 10 10 —— ——
标准品 —— —— 10 ——
蒸馏水 —— 10 —— ——
试剂1： 40 40 40 40
试剂2 10 —— 10 10
试剂5： 20 20 20 20
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充分混匀，37℃水浴准确反应20min————————————————————————————————————试剂6： 6 6 6 6
显色液： 60 60 60 60————————————————————————————————————
充分混匀，37℃避光反应20min，于25℃，3500转离心10分钟，去上清，留沉淀————————————————————————————————————
乙醇 200 200 200 200————————————————————————————————————
充分溶解沉淀后，于570nm处测定吸光值，分别记为A 测定管，A对照管，A标准管，A空白管，计算∆A测定=A测定管-A对照管；∆A标准=A标准管-A空白管。
结果计算：
1、标准曲线的绘制
以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值（∆A 标准 ）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将∆A测定带入公式中得到x（μmol/mL）。
2、乳酸含量计算
（1） 按照蛋白含量计算
LA含量（μmol/mg prot）= x×V样品÷（V样品×Cpr）= x÷Cpr。
（2）按照样本质量计算
LA含量（μmol/g 鲜重）= x×（V上清+V提取液二）÷ （W×V上清÷V提取液一）= 1.1875×x÷W。
（3）按照细胞数量计算
LA含量（μmol/10 6 cell）= x×（V上清+V提取液二）÷ （5×V上清÷V提取液一） = 0.2375×x。
（4）按照液体体积计算
LA含量（μmol/mL）= x×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]= 13.0625×x。
V样品：加入的样品体积，0.01mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；5：细胞数量，5×10 6 个；V液体：液体样本体积，0.1mL。
注意事项 ：若测定吸光值超过1.5或∆A大于1.2，请将样品体积进行适当的稀释后再进行测定，并在计算公式中
乘以稀释倍数。
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