科研药盒，慎用于临床
                       二酰甘油试剂盒说明书
                      DAG(HY-60125)KIT
   二酰基甘油（diacyl glycerol）是激素信息传递的磷酸肌醇系统中具有第二信使作用的化学信息分子。是一个甘油分子的三个羟基中有两个羟基和两个脂肪酸缩合失去两分子水形成的酯。CDP-二脂酰甘油与肌醇可形成肌醇磷脂（磷脂酰肌醇）。肌醇磷脂经激酶作用生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（三磷酸肌醇，PIP2）。当激素、神经递质与膜受体结合后，激活G蛋白介导的磷酯酶C（磷酸肌醇酯酶，PIC）。催化PIP2水解产生肌醇三磷酸（IP3）和DG的反应。IP3能够促使内质网Ca2+库释放Ca2+，引起胞内游离Ca2+浓度瞬间增加，启动胞内Ca2+信号系统，继而激活蛋白激酶C（PKC），以磷酸化形式对许多蛋白质和酶进行修饰，进而调节和控制另外一系列的生理过程。由此可见PIP2水解可以分别产生两个胞内信使，分别激动IP3-Ca2+和DG-PKC两个信号传递途径，这两个信使途径相辅相成，又互相制约，从而建立了肌醇磷脂第二信使系统.
DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。
试剂：
试剂A：Tris缓冲液
试剂B：咪唑
试剂C：二酰甘油激酶
试剂D：氯仿甲醇混合液
试剂E：DTPA
试剂F：γ-32 P ATP
检测规程：
1. 1.1-1.7mg组织，氮气流中脱水烘干，溶解其中的脂质成分至20ul试剂中（含7.5%辛基-β-D-葡萄糖、5mM 心磷脂、1mM DTPA、PH7.0）。
2. 超声20秒，然后室温温育5-15分钟。
3. 加入50ul试剂（100mM 咪唑/盐酸缓冲液、100mM NaCl、25mM MgCl2、 2mM EGTA，PH6.6）
4. 加入10ul新鲜制备的试剂（含20mM DTT、1mM DTPA，PH7.0）
5. 加入10ul试剂（含二酰甘油激酶、10mM咪唑、1mM DTPA，PH6.6）
6. 加入10ul试剂（含10mM γ-32 P ATP，100mM 咪唑，1mM DTPA，PH6.6）
7. 混匀，室温温育30min。
8. 加入3ml 氯仿/甲醇混合液（体积比1：2），0.7ml 1% HClO4，混匀，加入1ml氯仿、1ml 1% HClO4，离心，2000g×5min
9. 上层水相丢弃，下层氯仿层用2ml 1% HClO4洗涤2次，每次洗涤后离心去上层液体。
10. 余下的氯仿层，取0.5ml至干净的试管中，氮气下吹干，然后加入100ul 含5% 甲醇的氯仿，
11. 吸取次液体20ul加入到丙酮激活的薄层层析板中，此板在氯仿/甲醇/乙酸（比例：65:15:5）的混合溶液中进行反应。
12. 通过放射自显影技术，分别测定出磷脂酸和神经酰胺中r-32p的位置
13. 将此斑点刮掉放入装有10mlBioflur的小瓶中
14. 侧斑点的放射性，通过Parkard 2000 CATricarb 的液体闪烁器进行测定
15. 在每次试验中利用磷脂酸和神经酰胺的数值制作一条标准曲
       图1示    神经酰胺典型的标准曲线
 
计算：根据神经酰胺曲线计算二酰甘油浓度
样本处理及要求：
组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测。
正常叁考值：0.16～0.6 nmol/ml（肝组织））
各实验室应建立自己的正常值，正常参考值仅供参考：
注意事项：
1. 本法以定值血清为标准，准确性高。
2. 本产品仅用于体外诊断，避免直接接触皮   肤和眼睛，切勿吞咽。
3. 本产品应在2~8℃避光贮存，避免在2~8℃以上及0℃以下存放。
本实验回收系数：98.0%~99.55%
变异系数：      0.87%~3,28%

生产日期：
有效日期：
生产批号：

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