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您的位置:首页 >> 产品介绍 >> 实时荧光定量PCR
 
 

●简介

  原理:实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

 

●操作步骤

1 、RNA抽提 

2、RT –pcr

PCR反应体系

反应成分

体积(ul)

10×dNTP

4

10×Buffer

5

0.4

模板

1

引物

1

ddH2O

38.6

2-2 PCR反应条件

温度

时间

循环数

95℃

5s

1

95℃

30s

 

66.5℃

30s

35

72℃

15s

 

72℃

15s

1

4℃

 

 

3 实时荧光定量PCR

DNA Polymerase      DNA聚合酶

v dNTP              四种脱氧核苷酸

Buffer              缓冲溶液                  Mix

rox                 内参染料

SYBR GreenⅠ        荧光染料

v Primer F/R          引物(上游/下游)

v Template           模板

 反应条件:

95℃,10min;

95℃,15sec,

60℃,30sec,

72℃,30sec,

反应结束后,立即进行溶解曲线分析。

95℃,15sec,

60℃,60sec,

95℃,15sec,

60℃,15sec。

 

l 数据分析(结果分析)

扩增曲线                                          溶解曲线

 

●常见问题分析:

无 Ct 值出现

检测荧光信号的步骤有误:  一般 SG 法采用 72℃延伸时采集。

引物或探针降解:    可通过 PAGE电泳检测其完整性。 

模板量不足:    对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解:    避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Ct 值出现过晚

扩增效率低:  反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。 

PCR 产物太长:  一般采用 80-150bp 的产物长度。

PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。 

模板量低。

阴性对照有信号

Mix或水被污染。

如使用ROX校正,则可能为ROX 降解所致。

引物二聚体的出现:35循环后出现属正常,配合熔解曲线进行分析提高退火温度;降低引物浓度;冰上操作;重新设计引物

溶解曲线不止一个主峰

引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的 mix 试剂盒。 

模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组 DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

重复性差

1.加样不准确。

2.仪器在样品上温度条件有差异,即温度均一性不好。

3.模板浓度低。样品初始浓度越低,重复性越差,应减少样品的稀释倍数。

扩增曲线异常

基线设置有误。

高浓度的模板会导致CT值过早出现,即基线范围变小,导致机器读取荧光数值有误

扩增熔解曲线不同,ct值却相同

模板起始浓度相同,扩增效率不同。

预实验时为单峰,正式时为杂峰

引物有问题:使用另一对引物则为特异性扩增。

 

 ●特点:

1、特异性好,使用特异性探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性.同时,靶序列由引物和探针双重控制,特异性好、假阳性低.

2、灵敏度高,荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术,因此它的检测灵敏度很高.

3、线性关系好、线性范围宽,由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量;定量范围可在 0-1010拷贝/毫升.

4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染.扩增和检测可以在同一管内检测,不需要开盖,不易污染;同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理,不再需要担心放射性污染.

 

●注意事项:

1、为保证实验的精确性,请客户在取样前与我们取得联系,我公司会派专人去协助取样;客户也可直接提供纯化好的总RNA/DNA(≥ 3 ug/ 样本)。

2、请通过 E-mail 提供已知的全长基因序列。

3、希望提供详细的背景资料:生物物种信息,DNA/ RNA来源、基因丰度等。

 

●服务流程

1、 根据客户提供的信息设计实验。

2、 出具实验报告以及图表

 

●检测项目:

检测种类

核酸种类

产品名称

规格

肝炎类

DNA类

乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

20人份/盒

DNA类

乙型肝炎病毒(HBV)基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)

10人份/盒

DNA类

乙型肝炎病毒(HBV)YMDD基序突变检测试剂盒(PCR反向点杂交法)

10人份/盒

DNA类

乙型肝炎病毒(HBV)前C区BCP区突变检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)

10人份/盒

RNA类

丙型肝炎病毒(HCV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

10人份/盒

RNA类

丙型肝炎病毒(HCV)基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

10人份/盒

性病类

DNA类

沙眼衣原体(CT)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

20人份/盒

DNA类

淋球菌(NGH)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒

20人份/盒

DNA类

解脲脲(UU)原体核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒

20人份/盒

DNA类

人乳头瘤病毒(6,11型)(HPV6,11)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)

20人份/盒

DNA类

单纯疱疹病毒II型(HSV II)核酸扩增(PCR)荧光定量测定试剂盒

20人份/盒

RNA类

人类免疫缺陷病毒1型(HIV I)核酸定量检测试剂盒(巢式PCR-荧光法)

10人份/盒

DNA类

解脲脲原体基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)

10人份/盒

优生优育类

DNA类

人巨细胞病毒(HCMV)核酸扩增荧光定量检测试剂盒

20人份/盒

呼吸道类

DNA类

结核分支杆菌(TB)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒

20人份/盒

RNA类

甲型流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

24人份/盒

DNA类

肺炎支原体(MP)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光探针法)

20人份/盒

RNA类

呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

10人份/盒

消化道类

RNA类

柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

24人份/盒

RNA类

肠道病毒通用型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

24人份/盒

RNA类

肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

24人份/盒

DNA类

幽门螺旋杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

20人份/盒

肿瘤类

DNA类

EB病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒

10人份/盒

DNA类

高危型人乳头瘤病毒(8个型)(HR-HPV 8)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)

20人份/盒

DNA类

人乳头瘤病毒(16、18型)(HPV16,18)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒

20人份/盒

DNA类

人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法(RDB))

20人份/盒

遗传疾病类

DNA类

α-地中海贫血基因诊断试剂盒(gap-PCR法)

20人份/盒

DNA类

β-地中海贫血基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)

10人份/盒

DNA类

21-三体和性染色体多倍体检测试剂盒(荧光PCR毛细管电泳法)

50人份/盒

常见PCR检测项目表

 

 
 
 
 
                      
 
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