四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, C9H15N5O3,分子量241.25),是苯丙氨酸羟化酶的辅酶,在酶促反应中作为电子载体起还原剂的作用。其氧化型为二氢生物蝶呤,后者在二氢生物蝶呤还原酶催化下以NADPH为供氢体还原再生成为四氢生物蝶呤。四氢生物蝶呤不足或催化四氢生物蝶呤再生的还原酶缺陷,是苯丙氨酸羟化反应受阻、出现苯酮尿症的原因之一。四氢生物蝶呤(BH4)缺乏症,是高苯丙氨酸血症的一种亚型,是一种常染色体遗传性疾病,与苯丙酮尿症(PKU)同属于高苯丙氨酸血症(HPA),是截至21世纪初为止已确认的5000~6000种人类的罕见遗传代谢病之一,主要会对人的神经系统造成损害,导致患儿出现智力低下、癫痫等症状。
一、试剂盒组成:
1) 酶标试剂HRP 1 瓶。
2) BH4抗体1瓶。
3) BH4标准品6瓶,浓度为4、8、16、32、64、128 pg/ml
4) 终止液 1瓶。
5) 96微孔板1块
6) 显色液1瓶。
7) 稀释液1瓶
8) 洗涤液
9) 说明书
10) 封板膜
11) 密封袋
二、操作方法:
1) 标本收集:空腹抽静脉血2ml离心取血清。
2) 标准品的稀释:(本试剂盒提供原倍标准品一支,用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释)。
3) 每孔加入抗体100ul包被2小时。
4) 弃去液体,甩干,每孔加稀释后洗涤液300ul,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。如此重复5次,拍干。
5) 每孔加入封闭液200ul,轻轻晃动混匀,室温静置30分钟。
6) 弃去液体,甩干,每孔加稀释后洗涤液300ul,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。如此重复5次,拍干。
7) 每孔加入包被液25微升,标本25微升,标准品50ul轻轻晃动混匀
8) 每孔加入HRP100ul轻轻晃动混匀,室温静置60分钟。
9) 弃去液体,甩干,每孔加稀释后洗涤液300ul,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。如此重复5次,拍干。
10) 每孔加入显色液100ul,轻轻晃动混匀,显色15分钟。
11) 每孔加入终止液100ul终止反应(此时蓝色立转黄色)。
12) 测定:以空白孔调零,在450nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
三、注意事项:
1.从2-8℃取出的试剂盒,在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。
3.建议所有标准品、样本都做双份检测。如标本中待测物质含量过高,请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再按说明书操作进行测定,计算时请最后乘以总稀释倍数。
4.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
5.为避免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
6.不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
7.底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
8.手工洗板方法:甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少300ul注入孔内,震荡30秒。根据需要,重复此过程数次。
9.自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中
10.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
11.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行检测。
四、本试剂盒主要技术参数:
1.标准范围:0-128 pg/ml
2.灵敏度: <0.4pg/ml 。
3.正常参考值:60±10.5pg/ml(n=30)
4.规格:96T/盒
5.保存:2-8℃
6.有效期:6个月(2-8℃)。
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