荧光定量PCR实验报告

一、实验器材及试剂

1、  实验器材

2、  主要实验试剂及耗材

75%乙醇：HyPure ^TMMolecular Biology Grade Water配制

离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。

二、荧光定量PCR实验步骤

1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

3）充分研磨直至无可见组织块。

4）13000g离心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

6）4℃下13000g离心8min。

7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11）4℃下13000g离心5min。

12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl oligo(dT)18。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制2管。

例如扩25ul体系，每管中加入2XGreen qPCRMix  12ul, cDNA模板1ul, 引物F 1ul, 引物R 1ul , DdH2O  10ul.  短离心，可上机。

2)PCR反应程序设置

延伸和溶解曲线要选荧光定量。

PCR延伸温度可根据引物的Tm值，GC含量设定。

4、结果处理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

K=A-B

表达倍数=2^-K