科研药盒，慎用于临床

柠檬酸合成酶试剂盒说明书

CS(HY-NE181)KIT

柠檬酸合酶（Citroyl Synthetase,CS）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理：CS催化乙酰CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

试剂盒组成：

提取液：液体 1 瓶

试剂一：液体 1 瓶

试剂二：液体 1 支

试剂三：液体 1 瓶

试剂四：粉剂 1 支，临用前加入1mL 双蒸水配制

试剂五：粉剂 1 支，临用前加入0.5ml 双蒸水配制

试剂六：粉剂 1 支，临用前加入1.5mL 双蒸水配制

操作步骤

1、样本前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液和10µL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2 将匀浆液 600g，4℃离心 5min。

3 将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS。

5 在沉淀中加入 200µL 试剂一和 2µL 试剂二，反复吹打充分混匀，用于CS测定，并用于蛋白浓度测定。

柠檬酸合酶操作步骤    单位（ul）

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                     测定管            对照管

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试剂三                172                186

试剂四                 7                  7

试剂五                 7                 ——

样本                   7                  7

试剂六                 7                 ——

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   将上述试剂按顺序加入微量玻璃比色皿/96 孔板中，加试剂六的同时开始计时，记录 412nm 波长下 10 秒时的初始吸光度 A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟（96 孔板放入恒温箱中）；迅速取出比色皿并擦干，412 nm 下记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2，并计算测定管的∆A1=A2-A1，对照管的∆A1’=A2-A1，∆A=∆A1-∆A1’。

CS活性计算 ：

1、按微量玻璃比色皿计算：

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃或 25℃下每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一

个酶活力单位。

CS（U/mg prot）=∆A÷（ε×d）×V 反总÷（Cpr×V 样本）÷T=1050×∆A÷Cpr

ε：TNB 的消光系数，13.6×10 -3 mL/(nmol·cm)；V 反总：反应体系总体积，0.2mL；d：比色皿光径，1cm；V 样本：加入的样本体积，0.007mL； T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

2、按96孔板计算：

CS（U/mg prot）=∆A÷（ε×d）×V 反总÷（Cpr×V 样本）÷T=1750×∆A÷Cpr

ε：TNB 的消光系数，13.6×10 -3 mL/(nmol·cm)；V 反总：反应体系总体积，0.2mL；d：比色皿光径，0.6cm；V 样本：加入的样本体积，0.007mL； T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、用 96 孔板测定时，根据测定管数量配制测定管工作液（试剂三、四、五、六）和对照管工作液（试剂三、四），因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。

5、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本鲜重计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

6、附：使用样本鲜重计算公式：

按样本鲜重计算：

1、按微量玻璃比色皿计算：

单位的定义：37℃或 25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS 上清（U/g 鲜重）=∆A1÷（ε×d）×V 反总÷（W×V 样本÷V 提取）÷T =1061×∆A1÷W

CS 沉淀（U/g 鲜重）=∆A2÷（ε×d）×V 反总÷（W×V 样本÷V 样总）÷T =212×∆A2÷W

CS（U/g 鲜重）=CS 上清+CS 沉淀=1061×∆A1÷W+212×∆A2÷W

∆A1：上清测定值；∆A2：沉淀测定值；ε：TNB 的消光系数，13.6×10 -3 mL/(nmol·cm)；V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；d：比色皿光径，1cm；V 样本：加入的样本体积，0.007mL；V 提取：提取液体积，1.01mL；V 样总：溶解沉淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；W：样本鲜重，g。

2、按 96 孔板计算：

将上述公式中的 d=1cm 改为 d=0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。              

有效日期：6个月

生产批号：20200330

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