巨噬细胞呼吸爆发实验操作步骤

一．试剂：

1. L-15培养基（含青霉素100IU/ml，链霉素100ug/ml，10IU/ml肝素，2%小牛血清）：100mlL-15培养基（加入62.5mg/ml 的青霉素（1600IU/mg）100ul， 100mg/ml链霉素100ul，100mg/ml 肝素钠盐（100IU/mg）100 ul， 小牛血清2ml）；

2. HBSS缓冲液：NaCl：8g；KCl：0.4 g；葡萄糖：1.0g；KH2PO4： 60mg；NaH2PO4•H2 O：90mg  100ml去离子水定容，pH用0.1mol/L NaOH 调至7.2（用0.22um过滤膜消毒），使用时10倍稀释。

3. 34% Percoll溶液：17ml Percoll溶液，5ml HBSS（×10），用去离子水定容至50m

4. 51% Percoll溶液：25.5ml Percoll溶液，5ml HBSS（×10），用去离子水定容至50ml

5.   NBT：将10mlNBT溶于10ml 1*HBSS中（用前取1ml 10*HBSS加入到9ml离子水中）

6.   PMA：将1mlPMA溶于1ml无水乙醇，分装到200ulPCR管中，每10ul，共100管，保存到-20℃冰箱

7.   NBT/PMA（1mg/mlNBT含1ug/mlPMA）；将10ulPMA储备液加入到10mlNBT溶液中（现配现用）

8.KOH（2mol/L）称取5.6gKOH溶于50ml去离子水

二．具体操作步骤

 1. 1、加入200ul L-15培养基到2ml EP管中，取10尾鱼的脾脏混为一个样放入2ml EP管中取样过程无菌操作，样品放在冰盒上。脾脏过100um尼龙筛网，用注射器橡胶头研磨，同时用200-250 ul的L-15培养基冲洗（用50ml 离心管接研磨液） 

2、取新的1.5ml EP管，按顺序加入400ul 51% Percoll溶液—750ul 34%Percoll溶液—200-250ul样品悬液

3、4℃，400g离心25min，用移液管吸取分布在34%/51%Percoll溶液的细胞，放入1.5ml EP管中，用1ml L-15培养基洗2次（1000g，10min，4℃） 

4、血球计数板统计样品悬液的活细胞数，用L-15培养基调整细胞浓度至3*107cfu/ml 

5、取100ul稀释后的悬液放入1.5ml EP管中，4℃，1000g离心10min，弃上清

6、加入1ml HBSS洗巨噬细胞2次

7、加入100ul NBT/PMA溶液，18-20℃遮光孵化45min（现配先用，用前将PMA加入NBT,注意避光）

8.加入100ul无水甲醇终止反应，静置10分钟，4℃，2000rpm离心10min，弃上清

9.用70%的甲醇洗3次（2000rpm，10min），风干

10.加入120ul 2M KOH和140ulDMSO涡旋震荡，溶液应呈淡蓝色

11.溶解后在630nm波长下，酶标扳每孔加入260ul反应液，以KOH/DMSO作空白测定各离心管溶液的吸光度