科研药盒，慎用于临床
多酚氧化酶试剂盒操作说明书
PPO（HY-M0095）KIT
多酚氧化酶(PPO）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
检测原理：
PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm 有特征光吸收。纤维素酶是一种复合酶。酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶。内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase）和纤维二糖酶。
试剂组成：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：5mL×1 瓶，4℃保存；
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液提取：
1、 细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （10 4个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、 血清（浆）或果汁样本的处理： 按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议取 0.1mL 血清（浆）或果汁加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 525nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）
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试剂名称（μL） 测定管 对照管
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样本 50 ——
煮沸的样本 —— 50
试剂一 200 200
试剂二 50 ——
蒸馏水 —— 50
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37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）中准确水浴 10min 后，95℃水浴 5min，冷却至室温， 10000g，25℃离心 10min，收集上清，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，525nm 处 检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A 测定-A对照。
注意：
煮沸样本的操作：取 300μL 离心上清于 EP 管中，进行 5min 95℃水浴处理；每个测 定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行 5min 95℃水浴处理。
PPO 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）或果汁 PPO 活性
单位的定义：每分钟每 mL 血清（浆）或果汁在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为一个酶活力单位。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反总÷(V 液× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷V 液
2、组织、细菌或细胞 PPO 活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为一个 酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为一个 酶活力单位。
PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为 一个酶活力单位。
PPO（U/10 4 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA V
反总：反应体系总体积，0.3mL；V 液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL； V 样：加 入样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样 本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）或果汁 PPO 活性
单位的定义：每分钟每 mL 血清（浆）或果汁在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.005 为一个酶活力单位。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反总÷(V 液× V 样÷V 样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷V 液
2、组织、细菌或细胞 PPO 活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.005 为一个 酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.005 为一个 酶活力单位。
PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.005 为 一个酶活力单位。
PPO（U/10 4 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T =0.24×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL； V 样：加 入样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样 本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
计算结果
以各标准管的单位浓度为横坐标，以各管透光度差值为纵坐标作图。（适用于分光光度计）
全自动或半自动生化仪直接读取数据
正常考值：
各实验室应建立自己的正常值，下列正常参考值仅供参考：
注意事项：
1. 样品测定值超过上限，用生理盐水稀释后重新测定，结果乘以稀释倍数。
2. 本法以定值血清为标准，准确性高。
3. 本产品仅用于体外诊断，内含叠氮钠，应避免直接接触皮 肤和眼睛，切勿吞咽。
4. 本产品应在2~8℃避光贮存，避免在2~8℃以上及0℃以下存放。
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