科研药盒，慎用于临床
亮氨酸基肽酶试剂盒操作说明书
LAP（HY-M0094）KIT
LAP是一种膜结合酶，广泛存在于肝、胆、胰等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。 各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，LAP可以作为各类肝病的一项 初步检测指标，特别是肝癌鉴别诊断的指标。
检测原理：
LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有****吸收峰，通过测定吸光值 升高速率来计算LAP活性。
试剂组成：
试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入5mL丙酮溶解。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵
操作步骤
一、 样本处理：
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加 入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g， 4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测
二、测定操作：
1、分光光度计预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。
2、加样表：在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂
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试剂名称（µL） 测定管 空白管
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试剂一 —— 50
样品上清 50 ——
试剂一 850 850
试剂二 100 100
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在1mL玻璃比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于405nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置 于37℃水浴3min，拿出迅速擦干测定210s时的吸光值A2，计算△A测定管= A2测定-A1测定，△A空 白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次
三、酶活计算公式
1、液体 LAP 活力的计算：
单位的定义：每mL液体每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mL）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×109 ]÷V样÷T=675.4×∆A
2、组织、细菌或细胞中 LAP 活力的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U/mg prot）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(V样×Cpr) ÷T=675.4×∆A÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U /g 鲜重）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V样÷V样总) ÷T=675.4×∆A÷W
（3）按细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细胞每分钟生成1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U /104 cell）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.35×∆A V
反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×103 L / mol /cm；109： 单位换算系数，1mol=109nmol ；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总： 加入试剂一体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需单独测定；W： 样本质量，g；500：细胞总数，500万。
注意事项： 1、 △A大于0.5时或者A值大于1.5时建议将样品上清用试剂一稀释后再进行测定。 2、 空白管的△A变化小于0.01。
生产日期：2017-09-25
有效日期：2018-01-25
生产批号：20170925
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