科研药盒，慎用于临床
超微量ATP酶试剂盒操作说明书
Ca2+ - ATP（HY-M0027）KIT
ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺氧及一些疾病状态下，此酶活力发生一系列改变，另外有些遗传疾病也与此酶活力有关。
检测原理：
ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。
试剂组成：
试剂一 液体 4ml×1瓶 4℃保存6个月
试剂二 液体 2ml×1瓶 4℃保存6个月
试剂三 液体 2ml×1瓶 4℃保存6个月
试剂四 粉剂 粉剂×1支 -20℃保存6个月
试剂四的配制：用时每支试剂四粉剂加双蒸水5ml，充分溶解。（用不完-20℃以下可保存一周。）
试剂五 粉剂 粉剂×1支 4℃保存6个月
试剂五的配制：用时每支试剂五加双蒸水5ml，适当加热溶解，4℃保存3个月。
试剂六 粉剂 粉剂×1支 4℃保存6个月
试剂六的配制：用时每支试剂六加双蒸水10ml，室温保存3个月。
[注]：试剂六为过饱和溶液，所以在配制时最好用90℃～100℃的热双蒸水10.3ml（热胀冷缩）边隔水加热边用玻璃棒搅拌，以使其充分溶解。一次实验用不完再用时可能有结晶，用之前可以再次边隔水加热边玻璃棒搅拌使其溶解。
试剂七 液体 3ml×1瓶 4℃保存6个月
试剂七的配制：用时每瓶试剂七加双蒸水4.5ml，4℃保存6个月。
试剂八 10mmol/L标准磷贮备液 5ml×1瓶 4℃保存6个月
试剂九 （定磷剂） 甲液 7ml×2瓶 4℃保存6个月
乙液 6ml×2瓶 4℃避光保存6个月
[注]：定磷剂乙液在冬天或4℃长时间保存时可能会出现凝胶状物质，37℃溶解不了，可将其60℃左右水浴10分钟即可完全溶解；甲液、乙液应防止磷污染。
试剂十 终止剂 30ml×瓶 室温保存6个月
双蒸水 40ml×1瓶 4℃或室温保存
0.1μmol/ml标准磷应用液的配制：用时将10mmol/L磷贮备液100倍稀释，即取0.1ml加双蒸水至10ml。
定磷剂的配制：用时取一瓶试剂九甲液加入一瓶已预温好试剂九乙液中，充分混匀，需提前0.5小时配制，2～8℃条件下至少可保存5天，配好的显色剂的量够做13个管子（如果你的样本量很
少，所需的显色剂的量较少，那么你可以按试剂九中的甲液︰乙液=7︰6的比例自行配制显色剂，
需多少配多少（按比例配制显色剂时要防止磷污染，最好用专用吸嘴）。
样本前处理：
组织样本:准确称取组织重量,按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例,加入9倍体积的生理盐水，
冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清，即为10%匀浆上
清液;
血清样本：取抗凝全血1000～1500转/分钟，离心10分钟，取上层血浆。也可测血清，
测时将血清(浆)用生理盐水1︰19稀释；
全血样本：取0.1ml抗凝全血加生理盐水至10ml按1︰99稀释，取aml(一般取0.1ml)
检测，每个样本取样前必须充分混匀。
操作步骤：
1、 酶促反应：
——————————————————————————————————— 对照管 Ca2+－ATPase测定管
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试剂一（ml） 70 70
试剂二（ml） 20 --
试剂三（ml） -- 20
试剂四（ml） 20 20
试剂五（ml） -- 20
试剂六（ml） 20 --
样本（ml） -- 100
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混匀，37℃水浴准确反应10分钟
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试剂七（ml） 50 50
样本（ml） 100 --
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混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清150μl定磷。
2、 定磷：（0.02μmol/ml磷标准液及定磷剂的配制见前）
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空白管 标准管 对照管 Ca2+-ATPase测定管
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双蒸水（ml） 0.15 -- -- --
0.02μmol/ml磷标准液（ml） 0.15 -- --
上清液（ml） -- -- 0.15 0.15
定磷剂应用液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5
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混匀，室温静止2分钟
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终止剂（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5
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混匀，室温静置5分钟，在636nm处，0.5cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值
组织中ATPase的计算公式：
①、定义：规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1µmol无机磷的量为一个
ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时（µmolPi/mgprot/hour）。
②、公式：
组织中ATPase活力= 测定OD值-对照OD值 x 标准品浓度 x 6* x 2.8** ÷ 待测样本蛋白浓度
标准OD值-空白OD值
（U/mgprot） (0.02umol/ml) （mgprot/ml）
注： 6*:定义上为每小时，实际操作为10分钟反应，所以必须乘以6。
2.8**:反应体系中2.8倍稀释。
本试剂盒主要技术指标：
1. 样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。
2. 批内与批见应分别小于 9% 和 11%
生产批号：20200220
有效期：6个月
地址：北京市海淀区上地信息路2号上地七街国际创业园东区12层12A
北京华英生物技术研究所
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