脂褐质(LF)试剂盒说明书

        LF (HY-M0085)KIT

次级溶酶体在完成对绝大部分底物的消化分解作用之后，尚有一些不能消化分解的物质残留于其中，成为残留体，有些残留体可以通过细胞的排遗作用，以胞吐的方式被清除，但是有些会沉积在细胞内，常见于脊椎动物和人类的神经元、肝细胞、心肌细胞内的脂褐质。又称为致密体、老年色素、血褐脂、脂色素、黄色素、透明蜡体及残余小体等。

一、测定原理： 

脂褐质（Lipofuscin LP）是丙二醛与游离氨基的物质交联而成的具有荧光的化合物，可以用有机溶剂混合液萃取，用荧光分光光度计测其强度。

二.操作步骤：

（-）.准备工作

 1、10ml的玻璃试管，数量为n（样本管）+1（空白管）+1（标准管）

①如果您对结果要求十分精确，则您的空白管和标准管应该各2只

②因实验中间要换三次管子，并且为防止实验中间可能有管子被污染，因而必须多准备几只。

所以玻璃管总数为（n+2+2）×3+多准备的几只管子。

③实验中所用的玻璃器皿均需经过10%硝酸浸泡24小时后，自来水冲洗干净，再经蒸馏水冲

洗2～3遍，干燥后再用。不要用洗衣粉洗，因洗衣粉内含有大量荧光剂，不容易冲洗干净。

2.2套硬膜外穿刺针

3.1支5ml玻璃移液管，1支1ml玻璃移液管

（二）.详细操作

1. 称取适量的组织块，约300mg左右，按照实验方法学组织匀浆的制备加入9倍的蒸馏水制成

10%的水相组织匀浆。

2、 取水相组织匀浆2ml（取样前必须将组织匀浆充分混匀或摇匀），用5ml的玻璃移液管加入经50℃～60℃*预热后的有机溶剂混合液4ml；在混匀器上抽提30秒（即混匀30秒）间歇10s，共抽提3次。

3、 以3000～3500转/分离心10分钟，此时试管中液体分为三层，上层为水相，中层为组织沉淀层，下层为含有脂褐质的有机溶剂混合液层。

4.用硬膜外穿刺针小心吸净上层水相，再用另一套硬膜外穿刺针，装上针芯，沿管壁穿过中层，插到管底，再拔出针芯，吸取下层含有脂褐质的有机溶剂混合液2ml多到相应已编好号的第二套玻璃管中（注意：千万不可将水混入其中，若混入水，应在离心一次，再次用硬膜外穿刺针，装上针芯，沿管壁插到管底，拔出针芯，吸取下层含有脂褐质的有机溶剂混合液）

5.用2ml玻璃移液管移取2ml含有脂褐质的有机溶剂混合液到到相应已编好号的第三套玻璃管中，再加入0.2ml的试剂二，轻轻摇匀，使之澄清透明。

6.将上述液体置紫外线灯下放置60s，倒入石英比色杯中，用荧光光度计测定其荧光强度。

以0.1μg/ml的奎宁液为标准，试剂一与试剂二的有机溶剂混合液为空白，狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长（EX）360nm、发射波长(EM)450nm（在此条件下，标准品的荧光强度为55～60U），测定样本的荧光强度。

三．计算公式：

             样品管荧光强度—空白管荧光强度     标准品浓度   抽提液体积（4ml）

脂褐质含量= ————————————————×  （0.1ug/ml）×————————

（ug/g组织）       标准管的荧光强度                        参与抽提的样品含量（0.2g）

取10%组织匀浆2ml中含0.2g组织

注：  

1.可以将有机溶剂混合液放入50℃～60℃左右的水浴箱中预温20分钟以上，或者放70℃～80℃的水中，时间可缩短。

2.有些情况下（例如天凉时）抽提次数可再多1—2次，间隔期间将试管放入热水中加温，因为脂褐质在热的有机溶剂中易溶解，由于管子中液体比较多，为更好的混匀并且防止液体溅出，建议用带盖的玻璃管或用普通玻璃管加盖保鲜膜，用中指和食指夹住玻璃管，拇指将盖有保鲜膜的玻璃管口按紧，不可满把抓玻璃管，否则不能充分混匀。

3.吸取有机溶剂的第二套硬膜外穿刺针必须在每次使用前用有机溶剂混合液冲洗干净。如果您的比色皿较多时，您可以一只做空白，一只做标准，另一只做测定。如果比色皿较少，则在空白，标准，测定相互换着比色，要将比色皿用有机溶剂洗干净。如果有水分时也应冲洗干净。

有效日期：6个月

生产批号：20191026

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